Molekulare Membranbiologie

Prof. Dr. Dr. h.c. Hartmut Michel, Direktor

Ziel der Abteilung ist es, die Funktion von Membranproteinen und deren Arbeitsweise, genau zu verstehen. Dabei wird von einer genau bekannten, atomaren Struktur ausgegangen. Dies wird im Folgenden näher erläutert.

Grundsätzliche Eigenschaften biologischer Membranen und die Aufgaben von Membranproteinen

Die Zellen aller Lebewesen sind von Membranen umgeben, Zellen höherer Organismen werden von Membranen weiter unterteilt. Biologische Membranen bestehen aus Lipiden und Proteinen. Die Lipide bilden eine Doppelschicht (“bilayer”) aus, in welche die Membranproteine inkorporiert sind.  Lipiddoppelschichten sind für Ionen, geladene und größere polare Verbindungen unpassierbar. Als Folge dieser Eigenschaft können über die Membran hinweg Ionengradienten und elektrische Spannungen („Membranpotentiale“) aufgebaut und aufrecht erhalten werden. Membranproteine sind notwendig, damit ausgewählte Substanzen die Membrane durchqueren oder durch diese transportiert werden können. Eine der wichtigsten Aufgaben von Membranproteinen ist es deshalb, die Passage und den Transport sicherzustellen. Zusätzlich müssen Zellen miteinander kommunizieren, Signale austauschen und Informationen über ihre Umgebung sammeln. Viele Membranproteine sind deshalb Sensoren oder Rezeptoren. In der Regel erfolgt die Wechselwirkung mit dem Signalmolekül (z.B. einem Protein- oder Peptidhormon, einem Neurotransmitter, einem Ion) an der Außenseite der Zellmembran und der Rezeptor leitet das Signal durch die Membran weiter.  Membranproteine sind auch die zentralen Komponenten der biologischen Energiewandlung.  In der Photosynthese und bei der Zellatmung stellt der Transport von Elektronen und/oder Protonen den primären Schritt der Energiewandlung dar. Die entstehenden Membranpotentiale und Ionengradienten können dann dazu genutzt werden, die Synthese von Adenosin-5’-Triphosphat (ATP), die Aufnahme von Nährstoffen, das Ausschleusen von Abfallprodukten und von extrazellulären Proteinen sowie das Drehen der bakteriellen Flagellenmotoren anzutreiben. Schließlich arbeitet eine Reihe von Membranproteinen als Enzyme, und zwar besonders dann, wenn die Substrate der Reaktion hydrophober Natur sind.

Zusammenfassend können die Aufgaben von Membranproteinen wie folgt klassifiziert werden:

(i) Passage und Transport. Die Passage of polaren Substanzen und Ionen (“passiver Transport”) wird von Kanälen, Poren und Permeasen katalysiert. “Primär aktiver Transport” wird von ATP oder anderen energiereichen Substanzen angetrieben. Beim “sekundär aktiven Transport” wird der dem energetischen Gefälle folgende Fluss eines Ions (normalerweise eines Protons oder eines Natrium-Ions) an den Transport des Substrats gekoppelt.

(ii) Signalrezeption und Signalwandlung. Die wichtigsten Rezeptoren sind die G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Die Bindung des Signalmoleküls an den Rezeptor führt zu einer Aktivierung der sogenannten trimeren G-Proteine. Diese starten dann eine intrazelluläre Signalkaskade.

(iii) Biologische Energiewandlung. Die wichtigsten Beispiele sind die Atmungsketten von Mitochondrien und Bakterien. Hier wird die Oxidation von Substraten an den Transfer elektrischer Ladungen über die mitochondriale oder bakterielle Membran gekoppelt.  Bei der Photosynthese wird in den Reaktionszentren  die Energie des absorbierten Sonnenlichtes zu einer Trennung elektrischer Ladungen und zum Transport des Elektrons über die Membran genutzt.

(iv) Enzyme, bevorzugt für hydrophobe Substrate und/oder Produkte.

Diese auf ihre Aufgaben bezogene Einteilung  von Membranproteinen ist nicht immer einzigartig, weil beispielsweise ein Rezeptor ein Kanalprotein sein kann, welches bei Wechselwirkung mit dem Signalmolekül den Kanal öffnet oder schließt.

Ziele der Abteilung und die angewandten Methoden

Die Abteilung will zum Verständnis von Membranproteinen beitragen und insbesondere aufklären, wie Membranproteine arbeiten und welche Strukturänderungen erst ihre Funktion ermöglichen. Ein solches Verständnis ist nur auf der Grundlage genau bekannter atomarer Strukturen notwendig.  Solche genauen Strukturkenntnisse werden am besten mit Hilfe der Röntgenkristallographie gewonnen. Für ihre Anwendung werden jedoch wohlgeordnete Kristalle benötigt, deren Herstellung immer noch äußerst schwierig ist. Dennoch kann die Abteilung auf eine ganze Reihe von Erfolgen bei der Kristallisation von Membranproteinen und den nachfolgenden Strukturaufklärungen verweisen. Eine Liste wichtiger Membranproteinstrukturen, die in der Abteilung bestimmt worden sind, findet sich am Ende dieser Seite.

Sobald die Struktur eines Membranproteins aufgeklärt worden ist, bemühen wir uns sehr, ihre Wirkungsweise zu verstehen. Hierzu verwenden wir genetische Methoden, spezifische Markierungen und biophysikalische Techniken. Diese schließen gezielte Mutagenese, und die enzymatische und strukturelle Charakterisierung der entstehenden Varianten ein. Wir verwenden verschiedene spektroskopische Methoden, wie kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR), Fourier Transform Infrarot (FTIR) Spektroskopie und paramagnetische Elektronenresonanzspektroskopie (EPR), um an den Reaktionszyklus gekoppelte Strukturänderungen  des Membranproteins nachzuweisen. Diese spektroskopischen Experimente werden hauptsächlich in Kollaboration mit unseren Kollegen von der Universität Frankfurt (NMR: Profs. Glaubitz, Doetsch und Schwalbe, EPR: Prof. Prisner, FTIR: Prof. Mäntele) und deren früheren Mitarbeitern durchgeführt. Bei elektrophysiologischen Untersuchungen greifen wir auf die Expertise unserer Kollegen der Abteilung Biophysikalische Chemie zurück. Wir messen elektrische Ströme und Spannungen, welche die Aktivität unserer Membranproteine begleiten, wenn diese in Lipiddoppelschichten inkorporiert sind.

Die Anwendung von Methoden der theoretischen Biophysik, insbesondere elektrostatische Rechnungen und Molekulardynamiksimulationen, ist für das Verständnis der Wirkungsweise von Membranproteinen von großer Hilfe. Mit ihrer Hilfe lassen sich z. B. Vorhersagen betreffend die Rolle einzelner Aminosäuren machen, die dann experimentell geprüft werden können.

Überblick über die verschiedenen Projekte

Die Mitglieder der Abteilung bearbeiten eine Vielzahl von Membranproteinen aus verschiedenen funktionellen Klassen. Bei den Transportproteinen liegt unser Schwerpunkt bei den sekundär aktiven Transportern. Wir verwenden eine Art von Strukturgenomikansatz, bei dem wir das hyperthermophile Bakterium Aquifex aeolicus, dass mesophile Bakterium Salmonella typhimurium und das Archaeon (Archebakterium) Pyrococcus furiosus als Quelle für die Gene der von uns bearbeiteten Transporter verwenden. Wir konnten die Struktur des Natrium-Ionen/Protonen Antiporters NhaA von Escherichia coli,  einem solchen sekundär aktiven Transporter bestimmen. Zur Zeit bemühen wir uns, die Struktur der aktiven Form bei hohem pH zu ermitteln und den Transportmechanismus aufzuklären.

Bis vor kurzer Zeit haben wir alle Komplexe der mitochondrialen Atmungskette bearbeitet. Wir haben Strukturen der Komplexe II, III und IV aufgeklärt. Mit der Wegberufung von Roy C. Lancaster und Carola Hunte werden die Komplexe  II (Succinatdehydrogenase, Fumaratreduktase) und III (Cytochrom -bc1-Komplex) am Institut nicht weiter bearbeitet. Dagegen stellt die Arbeit an Komplex IV (Cytochrome-c-Oxidase) und anderen aeroben terminalen Oxidasen einen Schwerpunkt dar. In einem “Strukturproteomikprojekt” isolieren wir aus Membranen von Aquifex aeolicus  möglichst viele Membranproteine und Membranproteinkomplexe mit dem Ziel diese zu kristallisieren und ihre Strukturen aufzuklären. Unter diesen Membranproteinkomplexen befinden sich  die Atmungskettenkomplexe I (NADH-Dehydrogenase) and V (ATP-Synthase).

Unsere Arbeiten zur Struktur G-Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) werden fortgesetzt. Wir haben den Schwerpunkt auf die Erzeugung und Charakterisierung funktioneller Komplexe verlagert. Wir stellen die GPCRs und die mit Ihnen in Wechselwirkung tretenden Proteine rekombinant in der Hefe Pichia pastoris, in Insektenzellen, sowie in Säugetierzellenzellen unter Verwendung des Semliki Forest Virus Expressionssystems her.

Ulrich Ermlers Forschungsgruppe bearbeitet Enzyme mikrobieller Umbau- und Abbauprozesse, insbesondere  der methanogenen und methanotrophen Stoffwechselwege, der dissimilatorischen Sulfatreduktion und des Abbaus aromatischer Verbindungen. Die am häufigsten verwandte Methode ist die Röntgenkristallographie.

Methoden der theoretischen Biophysik werden angewandt, um die Strukturen von Membranproteinen zu analysieren. Wegen der hydrophoben Membranumgebung mit niedriger Dielektrizitätskonstante haben elektrostatische Wechselwirkungen bei Membranproteinen längere Reichweiten als bei löslichen Proteine und sind daher von besonderer Bedeutung. Molekulardynamiksimulationen  und Modellierung sind weitere Methoden um einzelne Aminosäuren zu identifizieren, die funktionell von besonderer Bedeutung sind. 

Mehr als andere Einrichtungen widmet sich die Abteilung der Entwicklung von Methoden zur Untersuchung von Membranproteinen.  Die zur Zeit verwendeten Strategien zur Kristallisation von Membranproteinen, entweder als Komplexe mit ihren Detergensmizellen (die Kristallkontakte werden dann von Aminosäureresten der außerhalb der Membran gelegenen polaren Oberflächen vermittelt) oder als Stapel zwei-dimensionaler Kristalle von Membranproteinen, stammen aus der Abteilung. Ebenso kommt der Gedanke der Kokristallisation von Membranproteinen mit Fragmenten monoklonaler Antikörper aus der Abteilung und wurde bei der Kristallisation und Strukturaufklärung der Cytochrome-c-Oxidase aus dem Bodenbakterium Paracoccus denitrificans hier erstmals erfolgreich umgesetzt. Eine andere Premiere war der Einsatz der methylotrophen Hefe Pichia pastoris zur Herstellung rekombinanter Membranproteine. Zur Zeit untersuchen wir verschiedene Systeme zur zellfreien Herstellung von Membranproteinen. Weil Membranproteine wohl eher als Lipid-Protein-Komplexe denn als reine Proteine arbeiten, bauen wir Systeme zur quantitativen Lipidanalyse unserer isolierten Membranproteine und Membranproteinkristalle auf. Hierzu greifen wir auf unsere Massenspektrometrieeinrichtung zurück. Diese wird auch zur Identifizierung der kristallisierten Membranproteine und ihrer möglichen Modifikationen eingesetzt. Parallel dazu versuchen wir neue Detergentien zur Solubilisierung und Kristallisation von Membranproteinen zu entwickeln.

Die Abteilung ist für den Aufbau des core centers G  der Europäischen Initiative INSTRUCT (INtegrated STRUCTural Biology infrastructure for Europe) als vorgesehener Teil des European Strategy Forum on Research Infrastructures (ESFRI) verantwortlich.  Core centre G hat seinen Schwerpunkt auf  Membranproteinen und stellt hochautomatisierte Geräte für die Membranproteinkristallisation, einen extrem leistungsstarken Röntgengenerator verbunden mit einem CCD Detektor zum Testen der Kristallqualität, und ein differential scanning calorimeter zur Ermittlung der Stabilität isolierter Membranproteine europaweit zur Nutzung zur Verfügung. Unsere Massenspektrometrieeinrichtung ist ebenfalls Teil des core centers G.

Die Abteilung hat in der Vergangenheit eine Internetseite enthaltend die Membranproteine bekannter Struktur (membrane proteins of known structure) bereitgestellt. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Kompilierung der Kristallisationsbedingungen. Aus Kapazitätsgründen kann die Internetseite nicht mehr aktualisiert werden. Da sie jedoch die einzige Datenbank ist, die Informationen über erfolgreich eingesetzte Detergentien und Fällungsmittel enthält, ist der Zugriff weiterhin möglich.

In der Abteilung bestimmte Strukturen von Membranproteinen

1prc Das photosynthetische Reaktionszentrum des Purpurbakteriums Rhodopseudomonas viridis (wird jetzt Blastochloris viridis genannt), erste atomare Struktur eines Membranproteins oder Membranproteinkomplexes. Für die Strukturaufklärung erhielt Hartmut Michel 1988 den Nobel Prize für Chemie zusammen mit Johann Deisenhofer und Robert Huber.

1pcr  Das photosynthetische Reaktionszentrum des Purpurbakteriums Rhodobacter sphaeroides.  Diese Struktur war die erste tatsächliche  Struktur der photosynthetischen Reaktionszentrums von Rhodobacter sphaeroides. Ältere Strukturen wurden unter Verwendung unzureichender Daten ermittelt. Eine Überverfeinerung führte zu einer fehlerhaften Abweichung von der Ausgangsstruktur, dem Reaktionszentrum von  Rhodopseudomonas viridis, welches zur Strukturlösung mit der Methode des molekularen Ersatzes („molecular replacement“)  eingesetzt worden war.

1qle, 1ar1, 3hb3 Die Cytochrome-c-Oxidase des Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans als Komplex mit einem Antikörper-Fv-Fragment. Dies war die erste vollständige Struktur eines Komplexes der Atmungskette.  1ar1, 3hb3  sind verfeinerte Strukturen des aktiven, aus zwei Untereinheiten bestehenden Kernkomplexes bei höherer Auflösung.

3mk7 Struktur der cbb3-Typ Cytochrome-c-Oxidase.

1lgh  Der Lichtsammelkomplex II (B800-850) des Purpurbakteriums Rhodospirillum molischianum (wird Phaeospirillum molischianum genannt).

1qlb  Die dem Atmungskettenkomplex II ähnliche Fumaratreduktase von Wolinella succinogenes.

1ezv  Atmungskettenkomplex III (Cytochrome-bc1-Komplex) der Hefe Saccharomyces cerevisisae als Komplex mit einem Antikörper-Fv-Fragment.

3cx5  Atmungskettenkomplex III (Cytochrome-bc1-Komplex) der Hefe Saccharomyces cerevisisae als Komplex mit einem Antikörper-Fv-Fragment und seinem Substrat Cytochrom-c.

1zcd  Der Natrium-Ionen/Protonen Austauscher NhaA von Escherichia coli (herunterregulierte Form bei pH 4).

3hyv, 3hyw, 3hyx  Die Sulfid-Chinon-Oxidoreduktase des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus, ein monotopes Membranprotein.

Kontaktinformationen:

Max-Planck-Institut für Biophysik

Prof. Dr. Dr. h.c. Hartmut Michel, Direktor
Abteilung für Molekulare Membranbiologie
Sekretariat: S. McCormack

Tel.: +49 (0) 69 6303-1001
Fax: +49 (0) 69 6303-1002

E-Mail: secretariat.michel(at)biophys.mpg.de