Gekoppelte zellfreie Transkriptions-Translations-Systeme
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Die zellfreie Expression hat sich als vielversprechender Ansatz für die schnelle und effiziente Herstellung von Membranproteinen für funktionelle und strukturelle Studien herausgestellt. Die Synthese von Proteinen aus Template-DNA oder mRNA wird in vitro entweder aus gereinigten Komponenten oder häufiger auf der Basis von Zellextrakten rekonstituiert, die die erforderliche Translationsmaschinerie bereitstellen. Die DNA-Transkription kann durch Ergänzung der T7-RNA-Polymerase initiiert werden, wodurch Transkription und Translation gekoppelt werden. Diese zellfreie Expressionstechnik kann viele der Probleme lösen, die mit der in vivo-Expression von Membranproteinen verbunden sind, wie z. B. Zelltoxizität, Proteinaggregation, Fehlfaltung oder Abbau. Die inhärente Offenheit des zellfreien Systems ermöglicht die Zugabe von Faktoren, die zur Stabilisierung des entstehenden Polypeptids, zur Erleichterung seiner Faltung und zur Förderung posttranslationaler Modifikationen wie der Bildung von Disulfidbindungen, der Phosphorylierung oder der Glykosylierung beitragen können. Membranproteine können direkt in einer definierten hydrophoben Umgebung untergebracht werden, die ihrer nativen Membranumgebung sehr ähnlich ist.
Zur Expression von Membranproteinen wenden wir robuste prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme an, die auf E. coli und Weizenkeimextrakten basieren. Bei der Verwendung des E. coli-Systems profitieren wir vom Fachwissen unserer Kollegen der Universität Frankfurt, mit denen wir eng zusammenarbeiten (Prof. Doetsch, Dr. Bernhard). Darüber hinaus ist die Entwicklung eines eukaryotischen Expressionssystems auf der Basis von Extrakten aus nicht pflanzlichen Quellen eines unserer Hauptinteressen.
Proteine im Fokus unserer Arbeit sind sekundäre aktive Transporter und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Sekundäre aktive Transporter bilden eine Klasse verschiedener integraler Membranproteine, die Transmembrangradienten verwenden, um den Transport von gelösten Stoffen über die Lipiddoppelschicht aktiv voranzutreiben. Sekundäre aktive Transporter spielen eine zentrale Rolle bei wesentlichen zellulären Funktionen wie Ionenhomöostase, Nährstoffaufnahme und Neurotransmission. Mehrere Erkrankungen des Menschen stehen im Zusammenhang mit dysfunktionellen sekundären aktiven Transportern, die die Bedeutung der Forschungsanstrengungen für eine pathophysiologische Beschreibung verdeutlichen. Einblicke in die Struktur und den Wirkungsmechanismus dieser Transporter werden das Verständnis des Membrantransports fördern und somit für die Arzneimittelentwicklung von hoher Relevanz sein.
In Zusammenarbeit mit der Abteilung für Molekulare Neurogenetik unter der Leitung von Prof. Peter Mombaerts interessieren wir uns für die Expression und anschließende strukturelle Charakterisierung von murinen Geruchsrezeptoren, die zur Superfamilie der heptahelischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) gehören. Ziel dieses Projekts ist es, die strukturellen Grundlagen der Geruchsdiskriminierung aufzuklären.