Hochauflösende KryoEM-löslicher Multiproteinkomplexe

Forschung von Janet Vonck & Werner Kühlbrandt

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Eine nahezu atomare (Seitenketten-) Auflösung durch KryoEM wird am leichtesten mit stabilen, wasserlöslichen Komplexen erreicht. Obwohl unser Hauptaugenmerk auf Membranproteinen und Membransystemen liegt, haben wir die Strukturen von drei solchen löslichen makromolekularen Anordnungen bestimmt, um hochauflösende Techniken in der Abteilung zu etablieren und herauszufinden, wie weit diese gehen können.

Abbildung 1. Hochauflösendes KryoEM von Multienzymkomplexen

(A) 3,4 Å Karte der Wasserstofftransferase Frh aus methanogenen Archaeen. (B) Ausschnitt aus der 3D-Karte mit angepassten Atommodellen der drei Proteinuntereinheiten in Cyan, Magenta und Blau, einem Ni-Fe-Zentrum, drei FeS-Clustern und einem Flavin-Cofaktor (gelb). Aus (Allegretti et al., ELife 2014). (C) 3,4 Å-Karte oder der Octameralkoholoxidasekomplex mit Monomeren der Untereinheiten in verschiedenen Farben. Aus (Vonck et al., PLoS One 2016).

Als unsere erste KryoEM-Struktur mit nahezu atomarer Auflösung und eine der allerersten in der „Auflösungsrevolution“ erhielten wir eine 3,4 Å-Karte der 1,2-MDa-Multienzym-Wasserstofftransferase Frh (Allegretti et al., ELife 2014) (Abbildung 1A). Die Dichtekarte (1B) ist aufgrund der hohen Qualität der experimentell bestimmten Phasen sehr klar, was es einfach macht, die Polypeptidketten und prothetischen Gruppen mit Standard-Kristallographieprogrammen anzupassen. Durch die erneute Verarbeitung der veröffentlichten Bilddaten und das Hinzufügen neuer Bilder in hoher Qualität haben wir die Auflösung erheblich erhöht und zum ersten Mal die 3 Å-Grenze überschritten. Ein weiterer löslicher Proteinkomplex, an dem wir arbeiten, ist die Alkoholoxidase aus Pichia pastoris, die die Röntgenkristallographie jahrzehntelang besiegt hatte. 1C zeigt seine CryoEM-Struktur bei einer Auflösung von 3,4 Å (Vonck et al., PLoS One 2016).