Aerobe terminale Oxidasen

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Terminale Oxidasen sind die terminalen Enzyme von Atmungsketten, die Elektronen von Donoren auf einen Endakzeptor übertragen. Die Atmungsketten aerober Organismen verwenden molekularen Sauerstoff als endgültigen Elektronenakzeptor. Die Atmungskette der Mitochondrien ist am bekanntesten. Seine terminale Oxidase, Komplex IV oder Cytochrom-C-Oxidase genannt, ist ein kanonisches Mitglied der Superfamilie der Häm- und Kupfer-haltigen terminalen Oxidasen. Aerobe terminale Oxidasen erzeugen ein elektrochemisches Protonenpotential über die Membran, da Elektronen von der Außenfläche der Mitochondrien oder von aeroben Bakterien abgegeben werden, während Protonen, die bei der Wasserbildung verbraucht werden, von der Innenfläche stammen. Die terminalen Oxidasen der Häm-Kupfer-Superfamilie pumpen zusätzlich Protonen durch die Membran. Es besteht allgemeiner Konsens darüber, dass zusätzlich zu den vier pro Disauerstoffmolekül verbrauchten Protonen vier zusätzliche Protonen von den kanonischen Oxidasen gepumpt werden.

Struktur der katalytisch aktiven Cytochrom-C-Oxidase mit zwei Untereinheiten aus dem Bodenbakterium *Paracoccus denitrificans*. Die Untereinheit I ist in Braun dargestellt, die Untereinheit II in Blau. Die Lipiddoppelschicht ist grün dargestellt, die wässrige Phase hellblau. Die Hämgruppen sind zwischen den Helices rot dargestellt und als Spalten dargestellt. Nach der aktuellen Arbeitshypothese werden Protonen aufgenommen, um die negative Ladung des reduzierenden Elektrons zu kompensieren. Sie werden über den Hämgruppen gespeichert. Protonen, die bei der Wasserbildung verbraucht werden sollen (zwischen Häm a3 und CuB), nähern sich der katalytischen Stelle getrennt über den K-Weg oder den D-Weg. Sie stoßen die zuerst aufgenommenen ladungskompensierenden Protonen elektrostatisch ab und pumpen sie so.

Struktur der katalytisch aktiven Cytochrom-C-Oxidase mit zwei Untereinheiten aus dem Bodenbakterium *Paracoccus denitrificans*. Die Untereinheit I ist in Braun dargestellt, die Untereinheit II in Blau. Die Lipiddoppelschicht ist grün dargestellt, die wässrige Phase hellblau. Die Hämgruppen sind zwischen den Helices rot dargestellt und als Spalten dargestellt. Nach der aktuellen Arbeitshypothese werden Protonen aufgenommen, um die negative Ladung des reduzierenden Elektrons zu kompensieren. Sie werden über den Hämgruppen gespeichert. Protonen, die bei der Wasserbildung verbraucht werden sollen (zwischen Häm a3 und CuB), nähern sich der katalytischen Stelle getrennt über den K-Weg oder den D-Weg. Sie stoßen die zuerst aufgenommenen ladungskompensierenden Protonen elektrostatisch ab und pumpen sie so.

Die Überfamilie kann in drei Familien unterteilt werden. Familie A enthält die kanonischen Oxidasen wie die mitochondrialen Cytochrom-C-Oxidasen oder diejenigen aus vielen Proteobakterien, einschließlich einiger Chinoloxidasen wie Cytochrom Bo aus Escherichia coli. Familie B besteht hauptsächlich aus archaischen und einigen bakteriellen Oxidasen und Familie C der Cytochrom-C-Oxidasen vom Typ cbb3. Letztere kommen nur in Bakterien vor, sie sind essentiell für die Stickstofffixierung und die Besiedlung von Wirtsgeweben durch pathogene Bakterien.

Die terminalen Oxidasen vom Typ Cytochrom bd, die in Bakterien und einigen Archaeen vorkommen, sind völlig unabhängig von den Häm-Kupfer-Oxidasen und pumpen keine Protonen.

In der Abteilung werden terminale Oxidasen aller vier Typen / Familien untersucht.

Kanonische Cytochrom-C-Oxidasen

Cytochrom-C-Oxidasen verwenden Cytochrom-C als Elektronendonor, um molekularen Sauerstoff zu reduzieren. Dementsprechend katalysieren sie folgende Reaktion:

4 cyt c^+II + O₂ + 8 H⁺_(i) → 4 cyt c^+III + 2 H₂O + 4 H⁺_(o)

Aus Cytochrom-C-Molekülen werden vier Elektronen bereitgestellt. Bei der Bildung von zwei Wassermolekülen werden vier Protonen verbraucht und vier Protonen gepumpt. Alle Protonen stammen von der intrazellulären Seite des Bakteriums oder Mitochondriums. Das resultierende elektrochemische Potential kann verwendet werden, um ATP durch die ATP-Synthase zu synthetisieren oder den sekundären aktiven Transport anzutreiben.

Nachdem wir die erste Struktur einer Cytochrom-C-Oxidase vom aa3-Typ (siehe Abbildung), einem Protein mit 4 Untereinheiten des Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans, bestimmt haben, wollen wir derzeit den Wirkungsmechanismus dieses wichtigen Enzyms verstehen. Sein aktives Zentrum besteht aus Häm a3 und einem Kupferatom (CuB). Sauerstoff wird an das Häm-a3-Eisen des doppelt reduzierten aktiven Zentrums gebunden. Die kanonischen Cytochrom-C-Oxidasen besitzen zwei Protonentransferwege (siehe Abbildung), den sogenannten K-Weg, der direkt zum aktiven Zentrum führt, und den D-Weg, der zu einem Glutamylrest führt (E278). Der weitere Weg ist nicht offensichtlich, aber es muss eine Möglichkeit für den Protonentransfer zum aktiven Zentrum und zum Hämpropionatbereich bestehen. Alle gepumpten Protonen scheinen den D-Weg zu nutzen, nur ein oder zwei Protonen, die mit der anfänglichen Reduktion der oxidierten Cytochrom-C-Oxidase einhergehen, werden über den K-Weg aufgenommen.

Die zu beantwortenden Fragen sind:

Welche der vier Elektronentransfers (von Cytochrom c zum aktiven Zentrum) sind an das "Proton pumping" gekoppelt?
Wie werden Protonen als Substrate oder gepumpte Protonen zugeordnet?
Wie ist die genaue Struktur der katalytischen Zwischenprodukte?
Befindet sich im aktiven Zentrum im oxidierten Zustand eine Peroxidbrücke?
Wo ist der Protonenausgang?

Wir beantworten diese Fragen durch ortsgerichtete Mutagenese, UV / Vis-Spektroskopie, EPR-Spektroskopie (zusammen mit Dr. Fraser MacMillan von der Universität von East Anglia in Norwich, UK), Atomabsorptionsspektroskopie (zusammen mit der Abteilung für biophysikalische Chemie). , Erzeugung von Zwischenprodukten des Katalysezyklus, Injektion einzelner Elektronen kombiniert mit kinetischen Messungen (Stop-Flow-Messungen) und Röntgenkristallographie von Zwischenzuständen und Varianten des Enzyms.

Diese experimentellen Ansätze werden durch theoretische Arbeiten ergänzt, nämlich elektrostatische Berechnungen und molekulardynamische Simulationen.

Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zu der vorherigen Annahme Protonen auch während der Reduktion des Enzyms vor seiner Reaktion mit Sauerstoff gepumpt werden. Der Mechanismus des Protonenpumpens muss noch geklärt werden.

Andere terminale Oxidasen

Wir versuchen, ausgewählte Mitglieder der anderen Klassen / Typen terminaler Oxidasen zu kristallisieren. Kürzlich ist es uns gelungen, die Struktur der Cytochrom-C-Oxidase vom cbb3-Typ aus Pseudomonas stutzeri zu bestimmen.