G-Protein gekoppelte Rezeptoren
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Bei Säugetieren bilden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die am häufigsten vorkommende Superfamilie integraler Membranproteine. Sie sind wichtige Vermittler für die Signalübertragung, die mit Signalmolekülen an der äußeren Oberfläche der Zellmembran interagiert und das Signal über die Membran überträgt. Beispiele für solche Signalmoleküle sind Nichtsteroidhormone, Neurotransmitter, Geruchsstoffe und (im Fall von Rhodopsin) sogar Licht. GPCRs können in allen Arten von Eukaryoten gefunden werden, von Amöben bis zu Pilzen, Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren. Das Genom des menschlichen Körpers kodiert für fast 900 GPCRs, von denen etwa 400 Geruchsrezeptoren sind. Für viele GPCRs wurde der natürliche Ligand nicht identifiziert, diese Rezeptoren werden als Orphan-GPCRs bezeichnet.
Es wurde geschätzt, dass ~ 50% aller Arzneimittel über die Bindung an GPCRs wirken. Daher ist es nicht nur für die Grundlagenforschung von großem Interesse, die Signalübertragung durch GPCRs zu verstehen, sondern auch für die Pharmaindustrie, da strukturelles Wissen über GPCRs für das Wirkstoffdesign und das virtuelle Screening angewendet werden kann.
Ein typischer GPCR besteht aus 7 membranüberspannenden Helices. Diese sind durch hydrophile Loops verbunden, die - je nach ihrem Auftreten - als extrazellulärer Loop (EL1 - EL3) oder intrazellulärer Loop (IL1 - IL3) bezeichnet werden. Außerdem tragen sie einen extrazellulären N-terminalen Tail und einen intrazellulären C-terminalen Tail, der in vielen Fällen palmitoyliert ist.
Die Signaltransduktion wird durch Bindung eines spezifischen Liganden an den Rezeptor initiiert. Je nach Ligandentyp binden sie an Intramembranbindungsstellen (Amine, Nukleotide oder Lipide) oder extrazelluläre Bindungsstellen (Proteinasen, Neuropeptide oder Proteohormone). Es gibt zwei Arten von Liganden für GPCRs: Liganden, die den Rezeptor für die Signalübertragung aktivieren ("Agonisten"), und Liganden, die den Rezeptor vorübergehend inaktiv machen ("Antagonisten"). Die Wechselwirkung mit einem Agonisten führt zu einer Konformationsänderung des GPCR, während die Wechselwirkung mit einem Antagonisten die Bindung anderer Liganden blockiert und den GPCR in einer inaktiven Konformation fixiert, wodurch jegliche Transmembransignalisierung verhindert wird. Es gibt auch allosterische Inhibitoren.
Die Bindung eines Agonisten induziert eine Konformationsänderung im Rezeptor, die dann auf seine cytoplasmatische Seite übertragen wird, wo der GPCR mit heterotrimeren G-Proteinen interagiert. Diese Proteine (bestehend aus den Untereinheiten Alpha, Beta und Gamma mit einer GDP / GTP-Bindungsstelle an ihrer Alpha-Untereinheit) bilden nur in ihrer GDP-Form ein stabiles Heterotrimer. Es ist noch unklar, ob heterotrimere G-Proteine konstitutiv an den GPCR gebunden sind oder ob Agonisten-aktivierte Rezeptoren zufällig mit den G-Proteinen interagieren. Der aktivierte Rezeptor wirkt nun als GDP / GTP-Austauschfaktor für das an den GPCR gebundene G-Protein auf der cytoplasmatischen Seite der Membran, wodurch die Dissoziation des heterotrimeren G-Proteins und die Freisetzung von aktivem GTP-Gα induziert werden. Diese Gα-Proteine transduzieren nun das Liganden-induzierte Signal durch Aktivierung von Enzymen, die die Produktion von Second Messenger katalysieren (zum Beispiel Aktivierung von Adenylylcyclase oder Phospholipase C). Nach kurzer Zeit führen sowohl die intrinsische GTPase-Aktivität von Gα als auch andere GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) zur Hydrolyse des Gα-gebundenen GTP, wodurch das Gα inaktiv wird und die Rebildung des heterotrimeren G-Proteins (Gα / β / γ) ermöglicht wird ).
Wie bei den meisten Membranproteinen sind jedoch alle GPCRs (mit Ausnahme von Rhodopsin, einem lichtaktivierten GPCR) nur in sehr geringen Mengen in Zellen vorhanden. Da Milligrammmengen an stabilem und homogenem Protein eine Voraussetzung für biophysikalische und strukturelle Untersuchungen sind, konzentrieren wir uns einerseits auf die heterologe Produktion rekombinanter GPCRs in verschiedenen Expressionssystemen und andererseits auf die Erstellung von Reinigungsprotokollen sowie biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen und Proteinkristallisation zur Bestimmung der Röntgenstruktur. In der Vergangenheit haben wir das Baculovirus-System und Insektenzellen, Escherichia coli, verschiedene Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris) und die durch das Semliki-Forest-Virus vermittelte Expression in Säugetierzelllinien verwendet. In einem genomischen Ansatz haben wir an mehr als 100 verschiedenen GPCRs gearbeitet, um die am besten geeigneten GPCRs zu identifizieren. Im Moment haben wir die Anzahl der GPCRs auf weniger als ein Dutzend reduziert. Diese werden je nach Rezeptor in Pichia pastoris, in Insekten- oder in Säugetierzellen exprimiert. Wir testen auch zellfrei gekoppelte Transkriptionsübersetzungssysteme für die Herstellung von GPCRs.
Unser Ziel ist es, die Struktur von nativen GPCRs und funktionellen GPCR-Protein-Komplexen in ihrem aktiven Zustand zu bestimmen. Die meisten unserer Ziele stammen von Säugetierarten wie Menschen, Mäusen und Ratten. Wir arbeiten auch mit NMR-Gruppen zusammen (Prof. C. Glaubitz, Uni Frankfurt, Prof. H. Oschkinat, FMP, Berlin), um die Konformation von Peptidliganden im Rezeptor-gebundenen Zustand durch Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie zu bestimmen.
Unsere Strukturstudien werden durch kollaborative fluoreszenzspektroskopische Techniken ergänzt, um Informationen über den oligomeren Zustand unserer GPCRs in ihren nativen Membranen zu erhalten.